Летучие мыши обнаруживают предметы, преграждающие им путь, испуская неслышимые для человека звуки и улавливая их эхо, отраженное от предметов. До открытия ультразвуковой эхолокации предполагалось, что летучие мыши обладают экстрасенсорным восприятием. Их лишали возможности использовать зрение, покрывали крылья плотным лаком, чтобы лишить возможности чувствовать воздушные потоки, и все равно они избегали расположенных в экспериментальной камере препятствий.
Исследования доктора О. Хенсона, анатома Иельского университета, показали, что в момент испускания разведывательных ультразвуков мышцы в ушах летучих мышей закрывают ушные раковины для предотвращения повреждения слухового аппарата.
Во время полёта летучие мыши поют песни, используя сложные сочетания слогов, на высоких частотах (что обусловлено их способностью к эхолокации). Они создают ультразвуковые волны от 40 до 100 кГц. Зов бразильского складчатогуба включает от 15 до 20 слогов. Ухаживая за самкой, каждый самец поёт свою собственную песню, хотя в целом мелодии всех песен похожи. Разница заключается в индивидуальном сочетании различных слогов. Сложные голосовые сообщения используются не только для ухаживаний, но также для опознавания друг друга, обозначения социального статуса, определения территориальных границ, при воспитании потомства и при противодействии особям, вторгшимся на чужую территорию. По мнению биолога Майкла Смотермана, ни одно другое млекопитающее, кроме человека, не обладает способностью общаться с помощью столь сложных голосовых последовательностей. Голосовой центр, ответственный за организацию сложных последовательностей слогов, у летучих мышей расположен несколько выше, чем у человека, и учёные пока не могут определить, где именно он находится.
Эхолокационные сигналы у детёнышей развиваются из призывных криков.
Летучие мыши, которые питаются рыбой (например, мексиканская рыбоядная мышь), патрулируют водную поверхность по ночам, излучая весьма сильные эхолокационные сигналы. Однако эти сигналы не проникают в толщу воды. Мышь не обнаружит рыбу, находящуюся под водой, но сразу же найдёт, если рыба высунет из воды хотя бы небольшую часть тела.
Эхолокация летучих мышей различается в разных семействах. Подковоносы излучают сигналы через нос, и эти сигналы представляют собой короткие (50—100 мс) ультразвуковые посылки с постоянной частотой 81—82 кГц, но в конце сигнала частота резко падает на 10—14 кГц. А гладконосые летучие мыши излучают через рот существенно более короткие (2—5 мс) сигналы с частотой, которая за это время падает с 130 до 30—40 кГц.
Летучие мыши способны обнаружить препятствие из проволок на расстоянии от 17 метров. Дальность обнаружения зависит от диаметра проволоки. Проволока диаметром 0,4 мм будет найдена с расстояния 4 метра, а диаметром 0,08 мм — с 50 см. Длина типичных локационных сигналов летучей мыши — около 4 мм. Однако мышь реагирует не только на толщину, но и на длину проволоки, в результате чего при достаточной длине отрезка проволока будет обнаружена.