Острожская Библия» состоит из 76 книг Ветхого и Нового завета (по сравнению с нынешними изданиями церковно-славянской Библии недостает только «Послания Иеремии»). Некоторые её части основывались на переводах Франциска Скорины. Среди источников указывают также «Геннадиевскую Библию» — рукопись конца XV века. Предисловие написано Г. Д. Смотрицким — отцом Мелетия Смотрицкого.
Имеются экземпляры с различными выходными сведениями, помещенными в конце книги. Небольшая часть экземпляров имеет на последнем листе текст выходных данных (колофон) в виде треугольника с датой 12 июля 1580, ниже помещена типографская марка Ивана Федорова. В других экземплярах текст оканчивается в два столбца, ниже типографской марки и выходных данных (на греческом и ц.-сл.) с датой 12 августа 1581 помещена концовка. В связи с этим часто говорят о двух различных изданиях книги. Однако на титульном листе всех известных экземпляров стоит 1581 год; по наблюдениям А. С. Зёрновой, описавшей 29 экземпляров, издание было одно, хотя по какой-то причине затянулось и некоторые листы были перепечатаны (в частности, исправлялись ошибки); разных комбинаций из перепечатанных и неперепечатанных листов достаточно много.
Как и все издания Ивана Федорова, «Острожская Библия» набрана и сверстана безупречно. В ней для основного текста применён мелкий, но удобочитаемый «острожский» шрифт, полууставный с элементами скорописных начертаний, и набор в две колонки. Объем текста оценивают в 3 240 000 печатных знаков. Острожская Библия практически без изменений была перепечатана в Москве в 1663 г., так что по сути являлась официальной редакцией славянской Библии до 1740-х годов, когда была подготовлена исправленная так называемая Елисаветинская Библия, используемая и поныне.