Летучие мыши не утроят себе гнезд или других каких-либо убежищ, а занимают самые разнообразные естественные и искусственные укрытия: пещеры, штольни, погреба, чердаки, дупла деревьев и пр. Убежища летучих мышей можно разделить на несколько групп.
Дупла деревьев — наиболее распространенные укрытия, их заселяют преимущественно ночницы, вечерницы, некоторые виды нетопырей и кожанов. При выборе убежища имеет значение для мышей форма летка (круглая, овальная, щелевидная). Зверьки отдают предпочтение дуплам, полость которых расположена выше входного отверстия. Дупла с большими пустотами они не заселяют из-за сквозняков, которые для рукокрылых губительны.
Основные обитатели дупел с круглыми и овальными летками — вечерницы и ночницы. Дупла с входными отверстиями в виде продольной щели занимают нетопырь-карлик и лесной нетопырь. Температура воздуха в дуплах устойчива, что особенно важно для летучих мышей, не обладающих постоянной терморегуляцией. Летом, несмотря на резкое повышение температуры воздуха снаружи в середине дня и на столь же резкое понижение ко второй половине ночи, температура в дуплах в силу их защищенности от солнечной радиации изменяется в течение суток на два-три градуса. Зимой же температура воздуха в дуплах изменяется аналогично изменениям ее снаружи.
Мы наблюдали, как одни и те же дупла с круглыми и овальными отверстиями в первую половину лета заселяли птицы (чаще всего скворцы), а во вторую — летучие мыши. То же самое отмечали мы и в птичьих дуплянках. С весны здесь гнездились мухоловки-пеструшки, а с июля поселялись летучие мыши. Адам Кшановский описывает несколько случаев, когда летучие мыши селились в птичьих дуплянках, в которых птицы уже насиживали кладку. Имеются сообщения и о том, что вечерницы заселяли дупла, занятые до их прилета шершнями.
Пещеры, штольни и другие естественные и искусственные подземелья используются летучими мышами в различные сезоны года. В одних пещерах они проводят только теплые летние месяцы, другие привлекают их как места для массовых зимовок. Сюда они слетаются осенью и проводят здесь всю зиму в спячке, а весной покидают убежище.
В Средней Азии есть Бахарденская пещера, где обитает до 40 тысяч летучих мышей, а в Бракенской пещере, расположенной на юге США, «прописано» свыше 20 миллионов этих зверьков.