Ферменти мають високу специфічність дії. Ця властивість суттєво відрізняє їх від небіологічних каталізаторів. Фермент може каталізувати одну або декілька близьких за природою хімічних реакцій. Така специфічність ґрунтується на суворій відповідності стеричної структури субстрату та активного центру ферменту. Структура активного центру ферменту відповідає структурі його субстрату, внаслідок чого даний фермент із багатьох речовин, що знаходяться у клітині, приєднує тільки свій субстрат.
Кожний фермент каталізує не будь-яке з усіх можливих хімічних перетворень субстрату, а яке-небудь одне. Завдяки специфічності дії ферменти забезпечують протікання з величезною швидкістю лише певних реакцій із усього різноманіття можливих перетворень у мік-ропросторі клітин цілісного організму, тим самим беручи участь у регуляції інтенсивності і спрямованості обміну речовин.
За ознакою специфічності ферменти можна розділити на дві групи: з абсолютною специфічністю і з відносною специфічністю. Ферменти, які каталізують перетворення тільки одного субстрату з певною структурою, володіють абсолютною специфічністю. Будь-які модифікації (зміни) у структурі субстрату роблять його недоступним для дії ферменту. Прикладом може бути уреаза, яка розщеплює лише сечовину, але не діє на модифікаційну форму - тіосечовину. Саха-раза гідролізує лише сахарозу, а на інші дисахариди не діє.
До абсолютної специфічності належить також і стереохімічна, яку мають ферменти, здатні діяти тільки на певні стереоізомери, наприклад, Б- або Ь-форми, цис- або транс-ізомери тощо, тобто фермент, який розщеплює або синтезує Ь-ізомер, діяти на Б-ізомер не буде. Якщо сполука існує у формі цис- і транс-ізомерів, то тільки один із цих ізомерів може служити субстратом для дії ферменту.