Специфичность является характерной чертой, отличающей ферменты от всех других небиологических катализаторов. Так, мелко распушенные платина, железо или никель могут выступать катализаторами разложения перекиси водорода на воду и кислород. Среди ферментов такое действие проявляет в основном каталаза. Таким образом, ферментам присуща выраженная специфичность действия. Каждый фермент действует на определенный субстрат или на определенную группу близких по структуре субстратов или на определенный тип связи в молекуле.
Высокая специфичность действия ферментов обусловлена конформаційною и электростатической комплементарністю между молекулами субстрата и фермента, а также особенностью структуры активного центра фермента, что обеспечивает высокое сродство с субстратом и избирательность течении одной какой реакции среди многих других, которые осуществляются в клетке. В активном центре есть функциональные группы для связывания соответствующего специфического субстрата, а также компоненты, которые превращают субстрат на продукт реакции. Такое свойство называют субстратными специфичностью фермента.
Относительная специфичность свойственна преимущественно ферментам пищеварительной системы, что имеет важное биологическое значение, потому что экономит средства воздействия на субстраты. Общим для рассмотренных выше ферментов является их действие на одинаковые связки определенной группы субстратов.
Большое количество ферментов характеризуется абсолютной специфичностью, т.е. способностью превращать только какой-то один субстрат. Примером таких ферментов может служить фермент уреаза, что катализирует превращение мочевины, но не влияет на метилсечовину; фермент аргіназа превращает аргинин, но не действует на метиларгінін; сукцинатдегідрогеназа окисляет сукцинат, но не действует на малеат.
Всей группе ферментов присуща стереоспецифічність, то есть способность влиять на один какой-то из стереоізомерів, например на D - или L-изомер. Так, ферменты катализируют превращение углеводов, действуют только на D-изомеры, но не влияют на L-изомеры; фермент фумараза катализирует превращение фумаровой кислоты, которая является транс-изомером, но не действует на цис-изомер - малеїнову кислоту.