Отношение русского правительства к казачеству в XVI в. было весьма противоречивым. После присоединения Казани и Астрахани русское правительство стало выражать особую заинтересованность в установлении прочного мира с ногайцами и в создании условий для безопасного судоходства на Волге. Оно начало вытеснять казаков с этой реки. Часть казачьей вольницы уходила на Дон, а также на Северный Кавказ; об уходе казаков "в Черкасы" (т.е. на Северный Кавказ) впервые сообщалось под 1563 г. Силы казаков на Дону и в Предкавказье были, однако, еще не столь велики. Не случайно в 1569 г. янычары и крымские татары беспрепятственно прошли вверх по Дону от Азова до Переволоки во время своего похода на Астрахань. Но во время отступления турецких войск от Астрахани казаки нанесли им удар вблизи Азова.
Однако с 1570 г. началось постоянное использование правительством донских казаков для выполнения отдельных поручений. В марте этого года атаману М. Черкашенину и казакам "его прибору" было поручено проводить от Рыльска к Азову посла И. Новосильцова. Царь Иван IV писал казакам, чтобы они Новосильцова слушали во всех государевых делах и "тем бы вы Нам послужили", "а Мы вас за вашу службу жаловать хотим". Официальная казачья историография именно с этого события 1570г. начинала историю войска Донского, и в 1870 г. отмечалось его трехсотлетие.
В 80-90-х гг. XVI в. отношения между казаками и русским правительством приобрели более регулярный характер, что определялось их заинтересованностью в поддерживании связей. Казаки Дона и Терека выполняли отдельные конкретные поручения правительства (проводы и встреча русских и турецких посольств, разведка, отдельные боевые поручения), за что получали жалование. Известно, что в 1571, 1584, 1592,1593 и 1594 гг. Москва присылала донцам жалование деньгами, хлебом, вином, порохом, свинцом, селитрой (для пороха), ядрами и сукном.
Казачество сохраняло полную самостоятельность. Правительство России в 90-х гг. уже предпринимало попытки подчинить себе эту вольницу, регламентировать ее жизнь и деятельность. В 1592 г. На Дон был прислан "в головы" боярский сын Петр Хрущов, но казаки его не приняли, заявив: "прежде мы служили государю, а голов у нас не бывало, а служивали своими головами, и ныне де рады служить своими головами, а не с Петром". Жесткие меры правительства Б. Годунова в отношении казачества - запрет донцам пересекать засечные черты государства для торговли, сопровождения освобожденного ими русского полона или на богомолье - способствовали нарастанию противоречий и активному участию казаков в событиях Смутного времени начала XVII в.