В 1768 возглавил второй оренбургский отряд академической экспедиции. Так началось знаменитое путешествие Лепехина, которое заняло около пяти лет (1768–1772). За это время он обследовал и изучил огромный район и блестяще выполнил все те многообразные и сложные задания, которые были поставлены перед молодым ученым: изучил природные богатства Поволжья, Урала, Сибири; подробно описал состояние промышленности, сельского хозяйства в посещенных им районах; уточнил и проверил географические карты, привез богатейшие зоологические и ботанические коллекции, описал множество новых видов животных и растений; собрал ценные материалы по зоогеографии, истории, экономике, этнографии, фольклору, народной медицине и ветеринарии. Результатом этого путешествия, своеобразным отчетом-дневником, где день за днем заносились все наблюдения путешественника, являются знаменитые «Дневные записки путешествия доктора и Академии наук адъюнкта Ивана Лепехина по разным провинциям Российского государства в 1768 и 1769 годах» (1771–1780, 1795, 1805).
Особое внимание привлекают Лепехина полезные ископаемые. Интересны его замечания о залежах полиметаллических руд на Урале. Основываясь на своих наблюдениях, он высказывал надежду, что эти руды будут найдены в южной части Уральских гор. Путешествуя по Среднему Уралу и проводя наблюдения, Лепехин снова высказывает предположение о том, что «здесь нами рождается надежда к приобретению цинковых руд и других полуметаллов, о которых у нас еще неизвестно».