Почти все летучие мыши (как и вообще рукокрылые) ведут ночной образ жизни, а днём спят, либо повиснув вниз головой, либо забившись в трещины деревьев, скал или в щели в постройках. Убежищами могут служить полости в деревьях, пещеры, гроты и различные искусственные сооружения, как надземные, так и подземные. Летучие мыши способны впадать в оцепенение, сопровождающееся уменьшением скорости обмена веществ, интенсивности дыхания и частоты сердечных сокращений, многие способны впадать в длительную сезонную спячку (до 8 месяцев). Благодаря умению регулировать скорость обмена веществ, многие насекомоядные летучие мыши могут долгое время обходиться без пищи, но из-за большой площади крыловых перепонок быстро теряют влагу и без свободного доступа к ней могут погибнуть от обезвоживания. В активном состоянии, как и все мелкие млекопитающие, имеют очень высокий уровень обмена, требующий, соответственно, много пищи; в среднем насекомоядная летучая мышь съедает за ночь около трети собственного веса. За одно лето колония из сотни особей поедает около 350—700 тысяч насекомых (многие из которых — вредители сельского и лесного хозяйства), крупная колония может уничтожить более 10 млн насекомых. До 158 км/ч способны набирать летучие мыши в горизонтальном полете, что быстрей любой птицы.