Родился 25 ноября 1810 г. в Москве. Выходец из большой семьи мелкопоместного дворянина, Пирогов вряд ли получил бы образование, если бы не знакомый родителей: известный московский врач, профессор Московского университета Е. Мухин заметил способности мальчика и стал заниматься с ним.
Пирогов оправдал надежды: уже в 14 лет он, прибавив себе два года, поступил на медицинский факультет Московского университета, а необходимость подрабатывать прозектором в анатомическом театре привела к выбору хирургии в качестве специальности.
По окончании университета (1826 г.) Пирогов отправился в Юрьевский (ныне Тартуский) университет. Здесь он работает в хирургической клинике и пять лет спустя защищает докторскую диссертацию.
В 26 лет становится профессором хирургии. В 1833 г. Пирогов уехал в Германию, где совершенствовал свои навыки в Берлинской и Гёттин-генской клиниках. Вернувшись, он издал свои знаменитые «Анналы хирургической клиники» и классический труд «Хирургическая анатомия артериальных стволов и фасций».
В 1840 г. Пирогов назначается на должность профессора Медико-хирургической академии в Петербурге. В 1843— 1848 гг. вышел в свет его «Полный курс прикладной анатомии человеческого тела». Пирогов впервые испытал действие наркоза (эфира) при операциях раненых в военно-полевых условиях на Кавказе, изучал паталогоанатомию холеры. Во время Крымской войны 1853— 1856 гг. он участвовал в организации военно-полевой медицинской службы, впервые в истории применил гипсовую повязку при лечении травматических переломов, ввёл институт сестёр милосердия. На основе собственного опыта Николай Иванович написал «Начала общей военно-полевой хирургии» (1865—1866 гг.).
В 1856 г. Пирогов оставил службу в Медико-хирургической академии. Его назначили попечителем Одесского учебного округа, затем Киевского. Просветительская деятельность учёного продолжалась вплоть до марта 1861 г., когда он был отправлен в отставку за вольнодумство и попытки изменить систему школьного образования.
Последние годы жизни Пирогов провёл в своём имении Вишня близ Винницы.
Умер 5 декабря 1881 г. Незадолго до смерти он сделал ещё одно открытие — предложил новый способ бальзамирования умерших. Именно по этой методике было забальзамировано тело самого Пирогова, хранящееся в специальном склепе в церкви села Вишня.